Zaloguj się
Koszyk
Mikrofluidyka pozwala na precyzyjne monitorowanie i kontrolę zdarzeń chemicznych lub biologicznych na poziomie mikroskalowym. W tej skali, porównywalnej do wymiarów komórki biologicznej, mikrofluidyczne wykrywanie i analiza pojedynczych komórek jest szczególnie interesujące, umożliwiając zastosowania układów typu lab-on-a-chip i point-of-care. Wykrywanie komórek jest zazwyczaj wykonywane za pomocą metod optycznych, takich jak FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting), gdzie komórki przechodzą przez wiązkę lasera, a rozproszone światło jest charakterystyczne dla komórek i ich składników. Jednakże, metody te wymagają dodatkowych i zazwyczaj czasochłonnych etapów umożliwiających oznaczanie. Spektroskopia impedancyjna (EIS) jest techniką bez etykietowania, która umożliwia pomiary w czasie rzeczywistym, o wysokiej przepustowości, metodą ułatwiającą proces ekstrakcji i przetwarzania danych. Urządzenia mikrofluidyczne z ciągłym przepływem, z wbudowanymi mikroelektrodami do pomiarów elektrycznych mogą być stosowane do wykrywania i klasyfikacji pojedynczych komórek lub cząstek (np. kulek lub kropelek), zapewniając uzyskanie wysokiej przepustowości. Ponadto, ponieważ właściwości dielektryczne komórki biologicznej są określane przez jej cechy komórkowe, takie jak objętość komórki, skład i budowa, spektroskopia impedancyjna może być używana do rozróżniania typów komórek. Podczas korzystania ze spektroskopii impedancyjnej, odpowiedź częstotliwościowa komórki może być mierzona i dopasowywana do modelu w postaci obwodu zastępczego. Pozwala to na wykonanie pomiarów ilościowych związanych z różnymi właściwościami komórki, takimi jak grubość błony komórkowej i przewodność cytoplazmy. Ponadto, możliwe jest również przeprowadzenie precyzyjnej analizy kropelek (ang. droplets) za pomocą EIS (rozmiar kropelek, liczenie, ilościowe określenie komórek w kropelkach).
Technika ta oferuje wiele kluczowych zalet w środowisku mikrofluidycznym, w tym:
Przedstawiamy naszą platformę spektroskopii impedancyjnej (EISP), składającą się z kontrolerów przepływu mikrofluidycznego firmy Fluigent, umożliwiających precyzyjną kontrolę przepływu, układu Micronit Microtechnologies B.V. umożliwiającego lokalizację obiektów badanych, oraz wzmacniacza lock-in firmy Zurich Instruments HF2LI do wykonywania pomiarów impedancyjnych w szerokim paśmie częstotliwości (maksymalnie do 50 MHz). Efektywność systemu demonstrujemy poprzez określenie rozmiaru mikrometrycznych kulek oraz pomiaru tempa generacji kropelek wody w oleju.
Zewnętrzne źródło ciśnienia jest podłączone do dwóch kontrolerów przepływu Fluigent Flow EZ, które są połączone z mikrofluidycznym układem Fluigent EZ Drop za pomocą przewodów. Przewody przechodzą przez jednostki przepływowe (Flow Units), co umożliwia pomiar przepływu. Wygenerowane kropelki przepływają do układu Micronit Electrical Impedance Spectroscopy (EIS) i przechodzą przez obszar detekcji. Wzmacniacz lock-in Zurich Instruments HF2LI dostarcza wzbudzenie napięciowe do różnicowych par elektrod na układzie EIS i mierzy prąd powrotny za pomocą transimpedancyjnego wzmacniacza prądowego HF2TA. Wizualizacja kanałów układu EZ Drop odbywa się za pomocą mikroskopu optycznego.
Flow EZ to najbardziej zaawansowany kontroler przepływu dla ciśnieniowej kontroli płynów. Może być połączony z jednostką przepływową (Flow Unit), aby kontrolować ciśnienie lub przepływ. Może być używany bez komputera. W przedstawionej tutaj konfiguracji używane są dwie jednostki Flow EZ o pełnej skali ciśnienia 2 barów. Może być pożądane użycie dwóch Flow EZ o pełnej skali 7 barów, ponieważ układ EIS stanowi barierę dla płynów, a wyższe ciśnienia mogą być konieczne do osiągnięcia optymalnego zakresu przepływu dla niektórych eksperymentów.
Jednostka przepływowa jest czujnikiem przepływu, który umożliwia pomiar przepływu w czasie rzeczywistym. Łącząc jednostkę przepływową z Flow EZ, możliwe jest przejście od kontroli ciśnienia do kontroli przepływu, co pozwala na generowanie wysoce jednorodnych kropelek przez długi okres czasu. Dla tej aplikacji używane są jednostki przepływowe M i L.
Faza ciągła: 3M™ Novec™ HFE7500 zawierający 2% dSURF. dSURF to biokompatybilny fluorosurfaktant zapewniający niezawodną produkcję kropelek i ich stabilność nawet w warunkach amplifikacji PCR. Zastosowano olej fluorowany zamiast oleju mineralnego ze względu na jego ogólnie lepsze właściwości (wysoka biokompatybilność, niemieszalność, niska lepkość). Faza rozproszona: Destylowana woda.
Układ EZ Drop Mikrofluidyczny układ scalony wykorzystywany do generowania kropelek to Fluigent EZ Drop. Chip wykonany jest z PDMS i wyposażony w trzy jednostki generujące kropelki. EZ Drop został zaprojektowany do generowania kropelek o szerokim zakresie rozmiarów (20–100 μm średnicy) oraz tempa generacji. Dzięki użyciu EZ Drop można generować wysoce monodyspersyjne kropelki (CV < 2%). Układ ten może być wykorzystywany w różnych zastosowaniach, takich jak enkapsulacja komórek, formowanie cząstek polimerowych. Kropelki generowane są za pomocą metody ogniskowania przepływu (rysunek nr 2): faza rozproszona jest wprowadzana bezpośrednio do głównego kanału, podczas gdy faza ciągła jest wtryskiwana przez dwa prostopadłe kanały. Faza rozproszona jest ściskana po obu stronach przez fazę ciągłą, co prowadzi do generowania kropelek.
Układ do spetroskopii impedancyjnej (EIS) Układ do spektroskopii impedancyjnej (EIS) został zaprojektowany przez firmę Micronit Microtechnologies B.V. Wykonany jest ze szkła borokrzemianowego oraz obojętnej warstwy pośredniej z suchego filmu rezystywnego, co umożliwia formowanie dobrze zdefiniowanych kanałów, idealnych dla jednolitego przepływu przez obszar detekcji. Standardowy projekt układów EIS obejmuje prosty kanał o głębokości 28 µm i szerokości 30 µm, co sprawia, że jest odpowiedni do zastosowań w analizie morfologii krwi. Układ posiada dwa zestawy podwójnych elektrod, z planarnym odstępem wynoszącym 20 µm oraz separacją głębokości wynoszącą 28 µm, zgodnie z głębokością kanału. Schemat przekrojowy rozmieszczenia elektrod można zobaczyć na rysunku nr 3.
Zurich Instruments HF2LI to wysokoczęstotliwościowy wzmacniacz lock-in, posiadający dwa kanały, wykorzystujący najnowsze technologie sprzętowe i programistyczne, aby zapewnić wiodące na rynku parametry techniczne i funkcjonalność. Rezerwa dynamiki wynosząca 120 dB ustanawia standard w zakresie częstotliwości 50 MHz.
W wielu konfiguracjach pojedynczy HF2LI zastępuje wiele tradycyjnych instrumentów. Podstawową funkcjonalność urządzenia można rozszerzyć dzięki opcji HF2LI-MF, co pozwala na jednoczesne pomiary na 6 częstotliwościach.
Wzmacniacz prądowy HF2TA przekształca 2 prądy wejściowe na napięcia wyjściowe w zakresie częstotliwości do 50 MHz. To urządzenie jest aktywną sondą prądową, którą można umieścić blisko zestawu pomiarowego. Obsługuje większość zastosowań, w których prąd musi zostać przekształcony na napięcie.
Zaawansowana konstrukcja HF2TA zapewnia stabilność i płynną pracę w całym zakresie częstotliwości. Połączenie tego wzmacniacza transimpedancyjnego z HF2LI umożliwia bardzo wysoką wydajność pomiarów i odporność na szumy tła dzięki dwóm kanałom i niskiemu poziomowi szumów.
Schemat układu mikrofluidycznego przedstawiono na rysunku nr 4. Zewnętrzne źródło ciśnienia jest podłączone do systemu LineUp składającego się z dwóch jednostek Flow EZ, które z kolei są podłączone do dwóch zbiorników, aby ustawić spadek ciśnienia między wejściem a wyjściem systemu. System jest w ten sposób pod ciśnieniem, co pozwala na lepszą kontrolę przepływu. Jeden zbiornik zawiera zawiesinę mikrocząsteczek do wstrzyknięcia (roztwór wlotowy), a drugi zbiornik służy do zbierania roztworu wychodzącego z chipu (pozostałości procesu pod ciśnieniem). Ciśnienie wlotowe jest zawsze wyższe niż ciśnienie wylotowe, aby utrzymać jednokierunkowy przepływ od wejścia do wyjścia. Zbiorniki są podłączone do mikrofluidycznego chipu EIS za pomocą rurek. Mikrokulki przechodzą przez pary elektrod w chipie, a pomiary impedancji są wykonywane za pomocą wzmacniacza HF2LI lock-in sprzężonego z wzmacniaczem prądowym HF2TA. Eksperyment przeprowadzany jest z użyciem kulek o średnicy 3 µm i 5 µm.
Schemat układu mikrofluidycznego przedstawiono na rysunku nr 5. Zewnętrzne źródło ciśnienia jest podłączone do systemu LineUp składającego się z dwóch Flow EZ, które z kolei są podłączone do dwóch zbiorników o pojemności 15 ml zawierających wodę i 3M™ Novec™ 7500 z 2% dSurf. Zbiorniki są podłączone do dwóch wlotów mikrofluidycznego chipu EZ Drop za pomocą rurek 1/16 o średnicy 250 µm oraz rurek PEEK 1/32 o średnicy wewnętrznej 254 µm i 157 µm. Rurki przechodzą przez jednostki przepływowe, aby umożliwić pomiar przepływu. Ciśnienie jest przykładane do dwóch zbiorników: woda jest wstrzykiwana do wewnętrznego kanału, a faza olejowa jest wstrzykiwana do otaczającego kanału mikrofluidycznego chipu. Wizualizacja kanałów chipu jest przeprowadzana za pomocą mikroskopu optycznego. Generowanie kropelek w kanałach EZ Drop przedstawiono na rysunku nr 6, gdzie obserwujemy wysoce jednorodne generowanie kropelek. Należy zauważyć, że w tym przypadku system nie był pod ciśnieniem na wylocie, ponieważ zbiornik na odpady nie był podłączony do kontrolera przepływu (rysunek nr 5).
Po wygenerowaniu, krople przepływają przez rurki wylotowe i są wstrzykiwane do mikrofluidycznego chipu EIS. Krople przechodzą przez pary elektrod w chipie, a pomiary impedancji są wykonywane za pomocą wzmacniacza HF2LI lock-in sprzężonego z wzmacniaczem prądowym HF2TA.
Korzystając z tego samego systemu mikroprzepływowego, który został przedstawiony w części 2 powyższego rozdziału „Materiały i metoda”, zawiesiny mikrocząstek o średnicy 3 µm i 5 µm są wstrzykiwane do układu EIS, gdzie cząstki przechodzą przez pary elektrod otaczających kanał mikroprzepływowy, umożliwiając wykonanie pomiarów impedancji.
Rysunek nr 7 pokazuje, że sygnały od kulek o średnicy 5 µm (niebieska linia) mają znacząco większe amplitudy niż dla kulek o średnicy 3 µm (czerwona linia) zarówno w X, jak i Y. Kulki o średnicy 5 µm wykazują zmianę amplitudy (wartość międzyszczytowa) w zakresie od 75 mV do 120 mV, podczas gdy dla kulek o średnicy 3 µm między 20 mV a 30 mV. Wyniki te dobrze odpowiadają różnicy w objętości między dwiema kulkami (czynnik 4,6). W ten sposób, wykorzystując analizę sygnału spektroskopii impedancyjnej, można rozróżniać cząstki lub komórki według ich rozmiarów. Możliwe jest zatem rozróżnienie między kulkami o średnicy 3 µm i 5 µm za pomocą naszego układu mikrofluidycznego.
Aby wykonać kolejny krok, eksperyment jest powtarzany przy użyciu tego samego układu mikrofluidycznego przedstawionego w części 3. sekcji „Materiały i Metody”. Kropelki wody w oleju są wstrzykiwane do chipu EIS, gdzie przechodzą przez pary elektrod otaczających kanał mikrofluidyczny, umożliwiając wykonanie pomiarów impedancji.
Rysunek nr 8 pokazuje zmierzoną impedancję przy 10 MHz. Wyraźne wartości maksymalne można zaobserwować w amplitudzie prądu i jego fazie, gdy każda kropla przechodzi przez parę elektrod. Informacje o fazie wskazują na wyraźną zmianę z charakteru rezystancyjnego (tylko płyn) na pojemnościowe, gdy krople przechodzą przez obszar pomiarowy pary elektrod. Dodatkowo, gęstość obserwowanych wartości maksymalnych na wykresie czasowym dostarcza użytecznych informacji o szybkości generowania kropelek i prędkości. Na przykład, 6 wartości maksymalnych zaobserwowanych w czasie 18 ms wskazuje na szybkość generowania kropelek wynoszącą 333 krople na sekundę. Biorąc pod uwagę odstęp między parami elektrod wynoszący 30 µm, średnia prędkość kropli jest obliczana jako 30 mm/s. W ten sposób technika ta może być używana do liczenia nawet szybko poruszających się kropelek, kulek lub komórek.
Jednoczesne pomiary wieloczęstotliwościowe przedstawione zostały na rysunku nr 8. W tym przypadku HF2LI wyposażony w opcję HF2-MF mierzy sygnał charakterystyczny dla impedancji (prąd) jednocześnie przy sześciu różnych częstotliwościach. Część urojona zespolonego sygnału prądowego zmienia się wraz z częstotliwością, zmieniając zarówno amplitudę, jak i fazę prądu zespolonego. Odwrócony sygnał zmierzony zarówno przy 497 kHz, jak i 27,69 MHz wynika z zależnych od częstotliwości właściwości dielektrycznych kropelek i definiuje potrzebę pomiaru przy wielu częstotliwościach jednocześnie. Jednoczesny pomiar wieloczęstotliwościowy oferuje pełniejszy obraz zależnych od częstotliwości właściwości dielektrycznych przechodzących kropelek (kulek lub komórek), jednocześnie oszczędzając całkowity czas pomiaru o czynnik 6.
Wykazaliśmy skuteczność naszego ekonomicznego systemu EISP poprzez określenie rozmiaru mikrocząsteczek oraz pomiar szybkości generowania i prędkości kropelek wody w oleju. Połączenie systemu LineUp z chipem EIS i wzmacniaczem lock-in Zurich Instruments HF2LI 50 MHz umożliwia szybkie wykrywanie i rozróżnianie pojedynczych komórek lub cząsteczek w przepływie z prędkością niedostępną dla rozwiązań wykorzystujących wyłącznie kamery. Ponadto, ta technika bez etykietowania może rozróżniać rozmiary cząstek i typy komórek dzięki wysokiej czułości analizy przy różnych częstotliwościach. Ostatecznie, zastosowanie EISP w skali mikrofluidycznej jest różnorodne i obejmuje takie aplikacje jak:
Design: Proformat